La revolucionaria técnica de microscopía ve átomos individuales por primera vez

Tecno 07 de junio de 2020 Por Dany
La microscopia crioelectrónica rompe una barrera clave que permitirá probar el funcionamiento de las proteínas con un detalle sin precedentes.
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Una técnica innovadora para la formación de imágenes de moléculas conocida como microscopía crioelectrónica ha producido sus imágenes más nítidas hasta el momento y, por primera vez, discernió átomos individuales en una proteína.

Al lograr la resolución atómica mediante microscopía electrónica criogénica (cryo-EM), los investigadores podrán comprender, con un detalle sin precedentes, el funcionamiento de las proteínas que no pueden ser examinadas fácilmente por otras técnicas de imagen, como la cristalografía de rayos X.

El avance, reportado por dos laboratorios a fines del mes pasado, consolida la posición de cryo-EM como la herramienta dominante para mapear las formas 3D de las proteínas, dicen los científicos. En última instancia, estas estructuras ayudarán a los investigadores a comprender cómo funcionan las proteínas en la salud y la enfermedad, y conducirán a mejores medicamentos con menos efectos secundarios.

"Realmente es un hito, eso es seguro. Realmente ya no hay nada que romper. Esta fue la última barrera de resolución ”, dice Holger Stark, bioquímico y microscopista electrónico en el Instituto Max Planck de Química Biofísica en Gotinga, Alemania, quien dirigió uno de los estudios1. El otro2 fue dirigido por Sjors Scheres y Radu Aricescu, biólogos estructurales en el Laboratorio de Biología Molecular del Consejo de Investigación Médica (MRC-LMB) en Cambridge, Reino Unido. Ambos fueron publicados en el servidor de preimpresión bioRxiv el 22 de mayo.

"La verdadera" resolución atómica "es un verdadero hito", agrega John Rubinstein, biólogo estructural de la Universidad de Toronto en Canadá. Obtener estructuras de resolución atómica de muchas proteínas seguirá siendo una tarea desalentadora debido a otros desafíos, como la flexibilidad de una proteína. "Estas preimpresiones muestran a dónde se puede llegar si se pueden abordar esas otras limitaciones", agrega.

Rompiendo fronteras
Cryo-EM es una técnica de décadas que determina la forma de las muestras congeladas por flash disparando electrones hacia ellas y registrando las imágenes resultantes. Los avances en la tecnología para detectar los electrones rebotados y en el software de análisis de imágenes catalizaron una 'revolución de resolución' que comenzó alrededor de 2013. Esto condujo a estructuras de proteínas que eran más nítidas que nunca, y casi tan buenas como las obtenidas de la cristalografía de rayos X, Una técnica más antigua que infiere estructuras a partir de patrones de difracción hechos por cristales de proteínas cuando son bombardeados con rayos X.

Los avances posteriores de hardware y software condujeron a más mejoras en la resolución de estructuras cryo-EM. Pero los científicos han tenido que confiar en gran medida en la cristalografía de rayos X para obtener estructuras de resolución atómica. Sin embargo, los investigadores pueden pasar meses o años obteniendo una proteína para cristalizar, y muchas proteínas médicamente importantes no formarán cristales utilizables; cryo-EM, por el contrario, solo requiere que la proteína esté en una solución purificada.

Los mapas de resolución atómica son lo suficientemente precisos como para discernir inequívocamente la posición de los átomos individuales en una proteína, a una resolución de alrededor de 1.2 ångströms (1.2 × 10–10 m). Estas estructuras son especialmente útiles para comprender cómo funcionan las enzimas y utilizar esos conocimientos para identificar medicamentos que pueden bloquear su actividad.

Para impulsar la crio-EM a la resolución atómica, los dos equipos trabajaron en una proteína de almacenamiento de hierro llamada apoferritina. Debido a su estabilidad similar a una roca, la proteína se ha convertido en un banco de pruebas para cryo-EM: una estructura de la proteína con una resolución de 1.54 ångströms fue el récord anterior.

Luego, los equipos utilizaron mejoras tecnológicas para tomar imágenes más nítidas de la apoferritina. El equipo de Stark obtuvo una estructura de 1.25-ångström de la proteína, con la ayuda de un instrumento que garantiza que los electrones viajen a velocidades similares antes de tocar una muestra, mejorando la resolución de las imágenes resultantes. Scheres, Aricescu y su grupo utilizaron una tecnología diferente para disparar electrones que viajan a velocidades similares; También se beneficiaron de una tecnología que reduce el ruido generado después de la carrera de algunos electrones de la muestra de proteínas, así como de una cámara de detección de electrones más sensible. Su estructura de 1.2-ångström era tan completa, dice Scheres, que podían seleccionar átomos de hidrógeno individuales, tanto en la proteína como en las moléculas de agua circundantes.

Stark reconoce que combinar las tecnologías podría llevar las resoluciones a alrededor de 1 ångström, pero no mucho más. "Por debajo de 1 Å es casi imposible alcanzar el cryo-EM", dice. Obtener una estructura de este tipo con la tecnología de punta existente requeriría "varios cientos de años de registro de datos y una cantidad no realista de potencia de cómputo y capacidades de almacenamiento de datos", estima su equipo.

Ver claramente
Scheres y Aricescu también probaron sus mejoras en una forma simplificada de una proteína llamada receptor GABAA. La proteína se encuentra en la membrana de las neuronas y es un objetivo para anestésicos generales, medicamentos para la ansiedad y muchas otras drogas. El año pasado, el equipo de Aricescu usó cryo-EM para mapear la proteína a 2.5 ångströms4. Pero con el nuevo kit, los investigadores lograron una resolución de 1.7 ångström, con una resolución aún mejor en algunas partes clave de la proteína. "Fue como quitar una mancha sobre tus ojos", dice Aricescu. "Con esta resolución, cada mitad de ångström abre un universo entero".

La estructura reveló detalles nunca antes vistos en la proteína, incluidas las moléculas de agua en el bolsillo donde se encuentra una sustancia química llamada histamina. "Esa es una mina de oro para el diseño de medicamentos basado en la estructura", dice Aricescu, porque muestra cómo un medicamento podría desplazar las moléculas de agua, lo que podría dar lugar a medicamentos con menos efectos secundarios.

Un mapa de resolución atómica de GABAA, que no es tan estable como la apoferritina, sería un desafío, dice Scheres. "No creo que sea imposible, pero sería muy poco práctico", debido a la gran cantidad de datos que tendrían que recopilarse. Pero otras mejoras, particularmente en cómo se preparan las muestras de proteínas, podrían allanar el camino para las estructuras de resolución atómica de GABAA y otras proteínas biomédicamente importantes. Las soluciones de proteínas se congelan en pequeñas rejillas hechas de oro, y las alteraciones en estas rejillas podrían contener proteínas aún más quietas5.

"Todos están muy entusiasmados y asombrados por el nivel de rendimiento verdaderamente asombroso demostrado por los grupos MRC-LMB y Max Planck", dice Radostin Danev, especialista en crio-EM de la Universidad de Tokio. Pero está de acuerdo en que la preparación de muestras es el principal desafío del campo para las proteínas más tambaleantes. "Sub-1.5-Å, o incluso sub-2-Å, el rendimiento de resolución seguirá siendo accesible durante algún tiempo solo para muestras con buen comportamiento", dice.

Es probable que los avances cimenten la posición de cryo-EM como la herramienta de referencia para la mayoría de los estudios estructurales, dice Scheres. Las compañías farmacéuticas, que codician las estructuras de resolución atómica, podrían ser aún más propensas a recurrir a la crio EM. Pero Stark cree que la cristalografía de rayos X retendrá cierto atractivo. Si una proteína se puede cristalizar, y eso es un gran si, es relativamente eficiente generar estructuras unidas a miles de medicamentos potenciales en un corto período de tiempo. Pero aún puede llevar horas o días generar suficientes datos para estructuras cryo-EM de resolución extremadamente alta.

"Todavía hay ventajas y desventajas para cada una de las técnicas", dice Stark. “La gente ha publicado muchos artículos y revisiones que dicen que estos últimos avances en cryo-EM serán la señal de muerte para los rayos X. Dudo que."

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